本實(shí)驗利用液相色譜法對番石榴葉粉中鞣花酸的含量進(jìn)行測定，為更廣泛地開(kāi)展番石榴葉開(kāi)發(fā)利用提供理論和。

1材料與方法

1.1材料與試劑

番石榴葉片，鞣花酸標準品美國Fluka公司；甲醇(色譜純)；甲醇、鹽酸(均為分析純)。

1.2儀器與設備

LC-20AD液相色譜儀(配SPD-20A紫外檢測器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器及CTO-10A柱溫箱)日本島津公司；Universal32R高速臺式冷凍離心機德國Hettich公司；Elix5超純水儀美國Millipore公司。

1.3標準溶液的配制

準確稱(chēng)取鞣花酸標準品40mg，轉移至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度均為400mg/L的混標溶液，隨后逐級稀釋至0.5、1、5、10、20、50、100、200mg/L。

1.4色譜分析條件

色譜柱為IntersilODS-SP色譜柱(250mm×4.5mm，5μm)，柱溫35°C，流動(dòng)相為3%冰乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫程序：0～4minB由20%升至45%，保持6min，10～15minB由45%升至70%，15～20min升至100%，保持1min；進(jìn)樣體積10μL。

1.5樣品處理

將所摘取的新鮮番石榴葉片分老葉、嫩葉、成熟葉，于105°C烘至質(zhì)量恒定，用粉碎機打成粉，分別準確稱(chēng)取1.0g粉末，放入100mL單頸瓶中，加入甲醇(含0.01%HCl)30mL，于70°C攪拌回流，2h后取出冷卻，用Whatman4號濾紙過(guò)濾，即得番石榴葉片粗提取液，置4°C冰箱備用。每個(gè)樣品設3次重復。

2結果與分析

2.1標準曲線(xiàn)的制作

取各級標準溶液，進(jìn)樣10μL，所得的色譜圖疊加如圖1所示，以標樣質(zhì)量濃度Y/(mg/mL)為縱坐標、標樣峰面積X/mV為橫坐標，繪制標準溶液曲線(xiàn)，計算線(xiàn)性回歸方程為Y=108711X－45231，線(xiàn)性范圍為0.5～200mg/L，相關(guān)系數為0.9998。

2.2精密度實(shí)驗

將同一番石榴葉提取液樣品(樣品代號2010.6.25)分裝于10個(gè)樣品瓶中，在同一天內重復進(jìn)樣5次，測定峰面積，并計算相對標準偏差(RSD)來(lái)考查其測定的精密度，得出峰面積的RSD為0.6%，保留時(shí)間的RSD為0.06%。同時(shí)將該批樣品連續測定5d，得出峰面積的RSD為1.13%，說(shuō)明精密度良好。

2.3回收率實(shí)驗

采用加標樣回收法，稱(chēng)取番石榴葉3份，每份樣量1.0g，分別加入1000μg/mL的鞣花酸標準溶液0.5、1mL，其他均按1.5節方法進(jìn)行，平行測定3次，計算回收率(回收率為用添加標樣樣品的測出量減去樣品測出量，再除以加入的標樣量，乘以100%)，結果見(jiàn)表3。結果表明平均回收率為95.86%～98.31%。

2.4樣品分析

2.4.1色譜分離效果

按照上述色譜條件，將嫩葉、成熟葉、老葉各樣品進(jìn)樣10.0μL進(jìn)行液相色譜分析，所得樣品色譜圖見(jiàn)圖2，與標準色譜圖(圖1)比較，可確定峰1為鞣花酸，峰1與前后相鄰兩峰之間的分離度均大于1.5，說(shuō)明該梯度洗脫方法可以成功地分離鞣花酸和其他組分。

2.  4.2番石榴葉片中游離鞣花酸含量

從表2可看出，番石榴葉片中游離鞣花酸含量以幼嫩葉居多，成熟葉次之，而老葉中不含鞣花酸。

3討論

番石榴葉提取物，必須采用梯度洗脫方法才能有效地分離鞣花酸和其他組分。